26 апреля бразильское Агентство санитарного надзора (ANVISA) выпустило пресс-релиз, в котором сообщалось о запрете на импорт в страну «Спутника V». Ведомство объяснило это тем, что эксперты нашли в лотах «живой» аденовирус, который может размножаться и теоретически вызывать у человека инфекцию. Российская сторона полностью отвергла такую возможность. Как выяснилось, бразильские эксперты сами не проводили исследование, а руководствовались документацией, предоставленной российской стороной. Однако риск возникновения этой проблемы, судя по всему, существует из-за технологии, выбранной разработчиками «Спутника».
Что нашли бразильцы?
Разрешить закупать российскую вакцину просили власти нескольких провинций. К пресс-релизу были приложены презентации с докладами трех бразильских регуляторов, участвовавших в экспертизе, а само рассмотрение вопроса проходило в онлайн-формате в течение нескольких часов и было выложено на YouTube.
Согласно докладу и выложенным презентациям, российская сторона направила в Бразилию пакет документов, а эксперты не обнаружили в нем «технической документации, которая бы гарантировала качество, безопасность и эффективность вакцины». В релизе говорится, что из-за этого эксперты были вынуждены собирать недостающую информацию из разных источников, в том числе лично посетить два места производства вакцины: на площадке компании «Генериум» в поселке Вольгинский Владимирской области и на производстве «Фармстандарта» в Уфе, заводе «УфаВИТ». В презентациях говорится, что на производство в Центре Гамалеи в Москве экспертов не пустили.
В докладе суммировано несколько недостатков, обнаруженных в процедурах исследования, производства и применения вакцины.
отсутствие четкой процедуры регистрации заболевания у добровольцев, участвовавших в исследовании эффективности, фактическое отсутствие в России, где вакцина применяется дольше всего, действенной системы фармаконадзора. С ее помощью можно было бы отслеживать появление нежелательных побочных явлений уже после начала массовой вакцинации.
Однако самым важным недостатком российской вакцины, по мнению экспертов ANVISA, стало обнаружение в ней реплицирующихся, то есть способных размножаться и заражать клетки человека, аденовирусов — RCA.
Хотя вакцина «Спутник V» сделана на основе аденовирусов, самих жизнеспособных аденовирусов в ней находиться не должно. Те вирусоподобные частицы, которые содержатся в вакцине (фактически они и являются вакциной), могут лишь однократно попадать в клетки человека и заставлять их производить антиген — S-белок коронавируса. Они не могут размножаться, поэтому в результате такого заражения человеческих клеток появления новых вирусных частиц не происходит. Реплицирующиеся аденовирусы в вакцине — это посторонние компоненты в медицинском продукте.
Вот что об этом говорится в пресс-релизе ANVISA:
Наибольшую озабоченность по результатам оценки данных, известных к данному моменту, вызывает тот факт, что клетки, используемые для производства аденовирусов, допускают их репликацию. Это может приводить к инфекции человека и вызывать повреждения и смерть, особенно среди людей с низким иммунитетом и проблемами с дыханием, наряду с другими медицинскими особенностями.
В презентации Генерального управления по медицинским и биологическим продуктам (GGMED) еще более определенно говорится, что в вакцине обнаружены RCA:
Реплицирующийся аденовирус обнаружен во всех лотах компонента II вакцины «Спутник V»: возможная рекомбинация. Компонент I не был протестирован на предмет наличия реплицирующегося аденовируса
Что ответили разработчики «Спутника»?
Доклад ANVISA привлек внимание ведущих научных журналистов и экспертов, которые назвали факт обнаружения в вакцине реплицирующихся аденовирусов неприятным сюрпризом, который «хотя и не должен вызвать больших проблем у вакцинированных, ведет к совершенно излишнему риску».
Колумнист Science Дерек Лёве предполагает, что сами по себе реплицирующиеся аденовирусы, скорее всего, не станут проблемой для вакцинированных, хотя и представляют собой совершенно лишний для вакцины риск.
Аденовирусы вызывают нетяжелое респираторное заболевание, которое возникает после того, как вирус попадает в клетки эпителия носоглотки. При внутримышечном введении сотни или даже тысячи аденовирусных частиц, которые, по-видимому, могут находиться в дозе российской вакцины, вряд ли приведут к каким-то тяжелым осложнениям. В крайнем случае может возникнуть какая-то чуть более тяжелая побочка, которая во время клинических испытаний, впрочем, выявлена не была.
На следующий же день после доклада ANVISA Российский фонд прямых инвестиций (РФПИ) — основной инвестор и экспортер вакцины — выпустил заявление, в котором опровергаются ключевые заявления экспертов. Разработчик утверждает, что бразильцы «имели полный доступ ко всем релевантным документам, центрам производства и разработки… а также прямой доступ к исследователям в Центре Гамалеи, ответственным за разработку вакцины».
Относительно основной проблемы — реплицирующихся аденовирусов — в ответе говорится, что «Центр Гамалеи ведет строгий контроль на всех точках производства „Спутника V“ и подтвердил отсутствие способного к репликации аденовируса (RCA) во всех лотах произведенной вакцины». Об этом, по утверждению РФПИ, сказано и в письме, направленном экспертам ANVISA еще до начала их работы — 26 марта 2021 года.
И кто прав?
Частично прояснить ситуацию и разрешить клинч «слово ANVISA против слова РФПИ» удалось небольшому бразильскому изданию Super Interresante, которое запросило комментарий регулятора своей страны. Журналисту Бруно Гарратонни в ANVISA признались, что на самом деле никаких тестов на обнаружение реплицирующиегося аденовируса эксперты в Бразилии не проводили. Все их выводы, цитаты из которых приведены выше, основаны на чтении документации, предоставленной самим РФПИ.
ANVISA отказалось предоставить копии этих документов журналисту, ссылаясь на то, что они принадлежат РФПИ. Однако Гарратонни обратил внимание, что бразильские эксперты в своем докладе упоминают несоответствие чувствительности тестов, приводимых в документации, той чувствительности, что принята по стандартам американского FDA по генетическим препаратам (эти стандарты, очевидно, выбраны как ориентир). По его предположению, именно это несоответствие стандартов чувствительности тестов на RCA в интерпретации экспертов ANVISA превратилось в «обнаружение аденовируса во всех лотах».
Два источника, знакомые с деталями работы производителей, взаимодействующих с Центром Гамалеи, утверждают, что такого рода тестирование на месте производства вакцины не делается. За него, как и вообще за контроль качества, полностью отвечает сам Центр Гамалеи, который поставляет и исходную культуру клеток для выращивания.
В ночь на 30 апреля эксперты ANVISA выступили на новой пресс-конференции, где фактически подтвердили правоту Гарратонни. Бразильские эксперты не только повторили свои первоначальные заявления, но и представили выдержки из досье, на основании которых был сделан вывод о наличии RCA в вакцине. Кроме того, на пресс-конференции представили и выдержки видеозаписей консультаций с представителями РФПИ.
Главный автор доклада, Густаво Мендеш, объяснил, как был сделан вывод о наличии RCA без проведения собственных лабораторных тестов: он был основан на сопоставлении данных из паспорта качества нескольких лотов вакцины и аналогичных данных по плацебо.
В первом случае в документах указывалось, что в препарате содержатся RCA в количестве менее 100 единиц при указанном рядом максимально допустимом значении 1000 единиц, а в документах по плацебо в аналогичной позиции было написано, что реплицирующиеся аденовирусы вовсе не обнаружены.
Когда мы сравниваем результаты анализов плацебо, то есть продукта, который не содержит вакцину, не содержит вирус, результаты показывают нулевой результат, «не обнаружено». Когда мы изучаем тем же методом, той же процедурой, результаты анализов вакцины, мы обнаруживаем «присутствие», как в спецификации. Эта спецификация [допустимого максимума] подразумевает количество в 300 раз выше, чем определено нормами FDA [для генно-терапевтических препаратов]. <…> Спецификация требует «не более 1×10³ реплицирующихся аденовирусов в дозе», а результат — менее 1×10² реплицирующихся вирусов. Эти числа должны быть равны нулю. В случае с плацебо, как я уже сказал, эта же самая спецификация показывает, что анализ дал нулевой результат. (с 13:46)
Важно отметить при этом, что Мендеш в качестве ориентира приводит значение, указываемое FDA для генно-терапевтических препаратов на основе аденовирусов, а не для аденовирусных вакцин. Вирусы-носители, которые при этом используются, могут быть очень разными, поэтому не ясно, справедливо ли применять нормы одних препаратов к другим.
Насколько удалось выяснить, общепринятых норм, которые регулируют уровень RCA именно в аденовирусных вакцинах, нет — видимо, в связи с небольшим числом таких вакцин.
Откуда вообще мог взяться посторонний вирус в «Спутнике»?
Простой ответ
Чтобы аденовирус, который становится носителем S-белка коронавируса, не мог бесконтрольно размножаться в теле вакцинированных, его лишают нужного для размножения гена. Однако во время производства такие вирусы должны все-таки как-то размножаться — для этого нужный ген вставляют в те клетки, в которых он выращивается. Иногда этот «ген размножения» может перепрыгнуть обратно из клетки в вирусную частицу за счет явления, которое называется рекомбинацией. Вероятность перескока зависит от того, какие используются клетки на производстве, — при производстве «Спутника V» эта вероятность относительно высокая, а при производстве вакцин AstraZeneca и J&J ниже. Использование технологии, которая применяется при производстве «Спутника V», — это не нарушение общепринятых норм производства аденовирусных препаратов, но решение, которое создает некоторые дополнительные риски. При этом, как уже сказано выше, пока нет никаких достоверных оснований считать, что реплицирующиеся аденовирусы в вакцине могут как-то влиять на здоровье вакцинируемых.
Ответ посложнее
Способный к репликации аденовирус (если он действительно присутствует в вакцине) мог попасть в нее двумя принципиально разными путями: через несоблюдение условий стерильности либо естественным путем — с помощью рекомбинации.
Несоблюдение стерильности производства представляется маловероятным, так как в таком случае аденовирус — наименьшая проблема, с которой может столкнуться производитель. Заражение культуры бактериями или грибами и полная потеря производимого препарата при этом гораздо более вероятна, чем незаметное попадание в культуру именно «чистого» аденовируса.
Второй путь — рекомбинация, которая гораздо более вероятна и считается важной проблемой при производстве аденовирусных вакцин и генетических конструкций. «Российские разработчики, имея возможность использовать для продукции вакцинного вируса такие клетки, в которых рекомбинации (то есть обмена генами) не происходит, тем не менее взяли в некотором смысле устаревшую конструкцию — которая и стала источником проблем», — полагает Константин Северинов.
Вкратце проблемы заключаются в следующем. Когда разработчики решают использовать для доставки антигена именно вирусный вектор, они могут пойти двумя путями: оставить для вируса возможность размножения в человеческих клетках или полностью лишить его этой способности — например, удалив нужные для этого гены. Обычно исследователи идут вторым путем, так как это позволяет обеспечить дополнительную безопасность препарата. При этом приходится жертвовать длительностью иммунитета, ведь не размножающийся вектор быстро пропадает из организма и иммунный ответ, получаемый на содержащийся в нем антиген, может быть слишком слабым.
Однако на производстве в культуре клеток вирус все-таки должен эффективно и быстро размножаться даже без необходимых для этого генов. Чтобы решить эту проблему, удаленные гены вводят в геном самой клеточной культуры, которая растет в реакторе на производстве, — в ней вирус может вести себя обычным образом. Попав в составе вакцины в организм человека, тот же самый вирус уже не сможет «занять» нужный ген у клетки-хозяина, поэтому и размножаться не сможет.
Проблема в том, что иногда — довольно редко — из-за схожести между фрагментами генома вируса-вектора и удаленными у него «генами размножения» может происходить обмен генетическим материалом между клеткой и вирусом — рекомбинация. В результате такого обмена вирус, лишенный нужных для размножения генов, может получить их обратно — часто с потерей гена, который выполняет роль «полезного груза». Вероятность рекомбинации не очень велика, но в случае длительного производства ненулевая. Она зависит прежде всего от длины совпадающих последовательностей между геномом вирусом и геномом модифицированной клетки.
И именно здесь выступают на передний план особенности устройства и производства вакцины «Спутник V». Судя по информации из патента, она относится к самому первому поколению аденовирусных вакцин, в котором блокирование репликации обеспечивается удалением аденовирусного гена E1 и переносом его в клетки HEK293. Еще в середине 1990-х было обнаружено, что при этом относительно часто возможно формирование RCA — как раз за счет рекомбинации между фрагментами гена E1 и оставшимися после его удаления из вирусного генома участками ДНК.
Чтобы бороться с этим явлением, были разработаны другие клеточные линии, заменяющие HEK293. Это прежде всего PERC.6 со специальной генетической конструкцией, содержащей ген E1, с которой не происходит такой рекомбинации. Именно эту клеточную культуру используют на производстве очень похожей на первый компонент «Спутника» вакцины от Johnson & Johnson.
Использование в случае «Спутника» более старой клеточной культуры, конечно, не означает нарушения процедуры производства или очевидную ошибку: у каждой клеточной линии есть свои плюсы и минусы с точки зрения производства. Еще одна аденовирусная вакцина, производства AstraZeneca, например, выращивается тоже на HEK293, но вакцина AstraZeneca создана на основе не вируса человека, а вируса шимпанзе — а он почти не способен рекомбинировать с генами человеческого коронавируса в HEK293.
Тем не менее в случае «Спутника» использование HEK293 в сочетании с классическим подходом к созданию аденовирусного вируса-вектора гарантированно подразумевает возможность рекомбинации. А значит, и необходимость тщательного контроля этого риска на производстве. Подробности того, как именно этот контроль организован в случае «Спутника», известны в настоящий момент только самому производителю.
