Майбутній гетьман народився в селі Мазепинці неподалік від Білої Церкви, в родині українського шляхтича. Навчався в Київському колегіумі та у єзуїтській школі у Варшаві, слухав лекції в університетах Західної Європи. Був придворним короля Яна Казимира, але в 1663 році залишив двір заради служби генеральним писарем у гетьмана Петра Дорошенка, а потім у гетьмана Лівобережжя Івана Самойловича.
Це був жорстокий час — московські царі не припускали навіть думки про можливість відродження незалежної України, а її гетьманів вважали «злодіями та зрадниками». Одного за одним вождів козацтва піддавали арештам, катуванням, засилали та страчували. Російські війська поводилися в Україні, як на території переможеного ворога.
За таких обставин Іван Мазепа прийняв гетьманські клейноди. У ці роки навіть згадування про Україну не як про частину Російської імперії жорстоко каралося. Але Мазепа, на відміну від попередників, обрав інший шлях — не кровопролитне протистояння, а терпляче дипломатичне лавірування між протиборчими силами. Населення України за чверть століття Руїни було доведене до відчаю, і розраховувати на новий підйом визвольного руху не доводилося. Для пом’якшення жорстокості встановленого в Україні режиму гетьман використовував усі можливі методи, в тому числі й підкуп, подарунки вельможам, підношення царю. Ціла армія агентів і розвідників працювала в інтересах України в Москві, Варшаві, Бахчисараї, Стамбулі. І все ж донос за доносом ішли до царського двору.
Фатальну роль зіграла в долі гетьмана Північна війна і, зокрема, славнозвісна Полтавська битва. Шведський король Карл XII проривався до Москви з півдня, через Україну, а незадовго до того між ним і Мазепою було укладено договір. 27 червня біля села Яковці під Полтавою відбулася вирішальна битва, у якій перемогу одержала більш численна російська армія. Мазепа і його козаки не брали участі в битві, однак гетьман знав, що це буде розцінене царем як зрада. Тому разом із залишками армії Карла XII Мазепа змушений був відступити за Дунай — на землі Туреччини.
Помста Москви не забарилася: розпочалися жорстокі переслідування прихильників Мазепи і їхніх сімей. Відтак за Дунай разом із гетьманом вирушило багато його найближчих сподвижників. Через кілька місяців Іван Мазепа помер на чужині, в селі Варниці поблизу Бендер. Лише восени 1999 року його прах було перенесено на батьківщину і поховано в колишній гетьманській столиці Батурині.
